細(xì)胞和CAR-T有望徹底改變醫(yī)藥保健，但這些產(chǎn)品的制造對(duì)質(zhì)量和安全保證策略提出了新的挑戰(zhàn)。在支原體檢測(cè)時(shí)尤其如此，支原體是一種無(wú)處不在且?guī)缀蹩床灰?jiàn)的細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)菌污染。這些挑戰(zhàn)是 2019 年 PharmaLab 支原體 qPCR 檢測(cè)會(huì)前研討會(huì)上演講的共同主題，特別是考慮到歐洲藥典第 2.6.7 章的預(yù)期修訂。共識(shí)點(diǎn)包括，使用細(xì)胞基質(zhì)進(jìn)行測(cè)試的重要性以及將 NAT 定位為快速第一線檢測(cè)的實(shí)施策略的潛力，然后通過(guò)基于培養(yǎng)的藥典方法進(jìn)行結(jié)果驗(yàn)證。

支原體檢測(cè)常見(jiàn)問(wèn)題解答

1. 基于基因、細(xì)胞和組織的先進(jìn)產(chǎn)業(yè)藥物 (ATMP) 如何給支原體檢測(cè)帶來(lái)挑戰(zhàn)？ 

生物制藥支原體檢測(cè)的一個(gè)關(guān)鍵挑戰(zhàn)是周轉(zhuǎn)時(shí)間，因?yàn)樯a(chǎn)延遲可能代價(jià)高昂，并且會(huì)限制急需藥物的供應(yīng)。這項(xiàng)挑戰(zhàn)源于常用的“經(jīng)典”藥典方法，這些方法以文化為基礎(chǔ)，需要數(shù)周時(shí)間才能產(chǎn)生結(jié)果。對(duì)更快地檢測(cè)支原體的需求以及監(jiān)管機(jī)構(gòu)對(duì)替代檢測(cè)方法的接受使核酸擴(kuò)增技術(shù) (NAT) 成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)。NAT 可以通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng) (PCR) 檢測(cè)支原體 DNA 的存在，從而將獲得結(jié)果的時(shí)間從幾周縮短到幾小時(shí)。

然而，周轉(zhuǎn)時(shí)間只是冰山一角。在實(shí)施基于 NAT 的方法以確保產(chǎn)品安全時(shí)，其他考慮因素也很重要。由于 ATMP 廣泛多樣， 隨著進(jìn)一步的創(chuàng)新擴(kuò)大了 ATMP 的方法和應(yīng)用范圍，這種多樣性也將隨著時(shí)間的推移而增加。

2.制造過(guò)程中的哪些階段是合適的測(cè)試點(diǎn)？

經(jīng)驗(yàn)表明，并非生物藥物或 ATMP 生產(chǎn)中的所有時(shí)間點(diǎn)都適合支原體檢測(cè)。應(yīng)根據(jù)支原體污染風(fēng)險(xiǎn)最高的點(diǎn)來(lái)選擇檢測(cè)點(diǎn)。對(duì)于 ATMP，除了用于發(fā)布測(cè)試的預(yù)處理收獲之外，還應(yīng)評(píng)估過(guò)程中的測(cè)試點(diǎn)以包括在內(nèi)，例如在幾代之后測(cè)試源材料或初始細(xì)胞起始材料。

3.哪些樣品類型適合支原體檢測(cè)？

培養(yǎng)上清液或其他無(wú)細(xì)胞基質(zhì)可能不足以進(jìn)行檢測(cè)，因?yàn)橹гw通常會(huì)附著甚至侵入細(xì)胞。顯然，樣本選擇是經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的測(cè)試策略的關(guān)鍵參數(shù)。此外，需要仔細(xì)考慮測(cè)試前的樣品制備步驟，以確保用于測(cè)試的樣品類型仍能代表產(chǎn)品。因此，建議避免或完全證明無(wú)細(xì)胞基質(zhì)是合理的。事實(shí)上，大多數(shù)商業(yè)測(cè)試開(kāi)發(fā)人員都在轉(zhuǎn)向細(xì)胞矩陣，并尋找方法來(lái)克服由高細(xì)胞數(shù)引起的技術(shù)障礙。

4.您如何構(gòu)建符合法規(guī)要求的簡(jiǎn)化驗(yàn)證設(shè)計(jì)？

從驗(yàn)證的角度來(lái)看，必須使用復(fù)雜的樣本 Christiana Schnitzler 曾在演講中提到過(guò)，她正在領(lǐng)導(dǎo) Boehringer Ingelheim 的一個(gè)團(tuán)隊(duì)對(duì) Roche CustomBiotech 的 MycoTOOL 支原體實(shí)時(shí) PCR 試劑盒進(jìn)行通用驗(yàn)證。該試劑盒設(shè)計(jì)用于處理天然樣品，Schnitzler 正在檢查該檢測(cè)方法是否對(duì) PCR 抑制劑、DNA 提取變異以及試劑和樣品處理具有穩(wěn)健性。她的目標(biāo)是證明該檢測(cè)的靈敏度至少與“經(jīng)典”藥典方法相當(dāng)。該團(tuán)隊(duì)關(guān)于檢測(cè)限的數(shù)據(jù)仍在收集中，但初步結(jié)果表明，十種測(cè)試的支原體可以達(dá)到法規(guī)要求的靈敏度（≤10 CFU/mL）。 

      Schnitzler 的實(shí)施方法將測(cè)定驗(yàn)證與可比性研究相結(jié)合，以確定 PCR 方法是否與“經(jīng)典”藥典培養(yǎng)和指示細(xì)胞培養(yǎng)方法一樣靈敏、特異和穩(wěn)健。在這一點(diǎn)上，只有在可以證明這種等效性的情況下，起始基于 NAT 的方法才能替代更費(fèi)力、樣本密集和冗長(zhǎng)的金標(biāo)準(zhǔn)方法。羅氏制藥多年來(lái)一直在其生產(chǎn)車間使用其 MycoTOOL 支原體實(shí)時(shí) PCR 解決方案，并利用基于培養(yǎng)的方法進(jìn)行驗(yàn)證。

5.您如何將基于 NAT 的方法實(shí)施到流程工作流中？

  基于 NAT 的商業(yè)支原體測(cè)試提供了優(yōu)化的檢測(cè)架構(gòu)的便利性，具有廣泛的物種覆蓋和高靈敏度，以及高通量測(cè)試和自動(dòng)化的選項(xiàng)。

  幾位演示者分享了對(duì)市場(chǎng)測(cè)試的評(píng)估和經(jīng)驗(yàn)教訓(xùn)，這些經(jīng)驗(yàn)教訓(xùn)可以使其他人更容易實(shí)施基于 NAT 的方法。例如，盧布爾雅那大學(xué)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)和免疫學(xué)研究所的 Andrej Steyer 強(qiáng)調(diào)需要具有低基因組拷貝與 CFU 比率 (GC:CFU) 且特征明確的驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)。

  Steyer 比較了 SYBR Green 支原體檢測(cè)和基于探針的 MycoTOOL 支原體實(shí)時(shí) PCR 試劑盒。Steyer 選擇專注于基于探針的試劑盒，因?yàn)樗憩F(xiàn)出更好的靈敏度和 CT 值的可變性更小，Steyer 檢查了它在兩個(gè)不同的循環(huán)儀和自動(dòng) DNA 提取上的性能。研究中使用的兩種支原體參考標(biāo)準(zhǔn)之間的 GC:CFU 比率有十倍的差異再次出現(xiàn)在所得的 PCR 和測(cè)序數(shù)據(jù)中。Steyer 建議“牢記支原體參考標(biāo)準(zhǔn)的質(zhì)量及其可能產(chǎn)生的影響?！?

6.歐洲藥典第 2.6.7 章的預(yù)期修訂對(duì)使用基于 NAT 的支原體檢測(cè)方法有何影響？

實(shí)施基于 NAT 的支原體檢測(cè)方法需要全面驗(yàn)證和證明性能至少與“經(jīng)典”藥典方法相當(dāng)。研討會(huì)上討論的主題強(qiáng)調(diào)了在驗(yàn)證和實(shí)施基于 NAT 的方法方面需要更詳細(xì)的指導(dǎo)。但是，必須確保具體建議不會(huì)分散制定與未來(lái)產(chǎn)品相關(guān)的指南的注意力。 

  現(xiàn)有基于 PCR 的支原體檢測(cè)的物種覆蓋范圍相當(dāng)全面。例如，MycoTOOL 支原體實(shí)時(shí) PCR 試劑盒理論上可覆蓋大約 150 種可培養(yǎng)和不可培養(yǎng)的菌株。這種廣泛的覆蓋范圍可用于通用驗(yàn)證。其中，維也納獸醫(yī)大學(xué)微生物學(xué)研究所教授 Renate Rosengarten 教授和 Mycosafe Consulting 主任建議擴(kuò)大使用基于 NAT 的方法進(jìn)行測(cè)試所需的支原體物種清單，以便根據(jù)產(chǎn)品相關(guān)性進(jìn)行選擇基于風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估確定的潛在進(jìn)入后的增長(zhǎng)能力。

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