在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中，qPCR（實(shí)時(shí)熒光定量 PCR）技術(shù)以其高靈敏度、高特異性和快速性等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)分析、病原體檢測(cè)等領(lǐng)域。然而，在實(shí)際操作過(guò)程中，實(shí)驗(yàn)人員常常會(huì)遇到各種問(wèn)題，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。本文將根據(jù)常見(jiàn)問(wèn)題及解決辦法，為大家詳細(xì)介紹 qPCR 實(shí)驗(yàn)中的注意事項(xiàng)。

一、擴(kuò)增曲線不光滑

擴(kuò)增曲線不光滑可能是由于熒光信號(hào)太弱，經(jīng)系統(tǒng)校正后產(chǎn)生。解決方法是確保 Mix 中預(yù)留的染料未降解；更換熒光信號(hào)收集更好的 qPCR 專(zhuān)用耗材。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，應(yīng)選擇質(zhì)量可靠的試劑和耗材，以保證熒光信號(hào)的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性。

Taq SYBR? Green qPCR Premix 是SYBR? Green I嵌合染料法專(zhuān)用qPCR試劑，為2×預(yù)混液，包含除引物和DNA樣品以外的所有qPCR組分，可減少操作步驟，縮短加樣時(shí)間，降低污染幾率。其核心組分是經(jīng)抗體修飾的熱啟動(dòng)Taq DNA聚合酶，配合精心優(yōu)化的Buffer體系以及PCR反應(yīng)促進(jìn)因子，使產(chǎn)品具有特異性強(qiáng)、擴(kuò)增效率高等特點(diǎn)，有效抑制非特異性擴(kuò)增，可對(duì)寬廣濃度范圍的模板進(jìn)行準(zhǔn)確定量，獲得穩(wěn)定可靠的qPCR結(jié)果。

　　預(yù)混液中含有獨(dú)特校正染料，與一系列 qPCR 設(shè)備兼容，包括需要 ROX 校正的儀器，實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中不需要額外添加染料來(lái)校正儀器。

二、擴(kuò)增曲線斷裂或下滑

當(dāng)模板濃度較高，基線的終點(diǎn)值大于 Cq 值時(shí)，會(huì)出現(xiàn)擴(kuò)增曲線斷裂或下滑的情況。此時(shí)，可以減小基線終點(diǎn)（Cq 值 - 4），重新分析數(shù)據(jù)。在實(shí)驗(yàn)前，應(yīng)合理估計(jì)模板濃度，避免過(guò)高濃度的模板對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生不良影響。

三、個(gè)別孔擴(kuò)增曲線突然驟降

如果反應(yīng)管內(nèi)留有氣泡，會(huì)導(dǎo)致個(gè)別孔擴(kuò)增曲線突然驟降。為避免這種情況，應(yīng)確保 Mix 完全溶解，請(qǐng)勿渦旋振蕩混勻；加樣完成后輕彈離心去除氣泡；延長(zhǎng)預(yù)變性時(shí)間至 10 分鐘，以去除氣泡。在加樣過(guò)程中，要細(xì)心操作，盡量避免產(chǎn)生氣泡。

四、反應(yīng)結(jié)束無(wú)擴(kuò)增曲線出現(xiàn)

反應(yīng)循環(huán)數(shù)偏少可能導(dǎo)致反應(yīng)結(jié)束無(wú)擴(kuò)增曲線出現(xiàn)?？梢栽O(shè)置循環(huán)數(shù)為 40，但更多的循環(huán)數(shù)會(huì)增加過(guò)多的背景信號(hào)。在設(shè)置實(shí)驗(yàn)參數(shù)時(shí)，應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況合理選擇循環(huán)數(shù)，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。

五、熒光信號(hào)采集步驟未設(shè)置或者設(shè)置錯(cuò)誤

兩步法擴(kuò)增程序一般將信號(hào)采集設(shè)置在退火&延伸階段，三步法擴(kuò)增程序應(yīng)當(dāng)將信號(hào)采集設(shè)置在 72°C 延伸階段。在實(shí)驗(yàn)前，要仔細(xì)檢查熒光信號(hào)采集步驟的設(shè)置，確保設(shè)置正確。

六、引物可能降解

長(zhǎng)期未用的引物可能會(huì)降解，應(yīng)先通過(guò) AGE 電泳檢測(cè)完整性，以排除這種可能。對(duì)于長(zhǎng)期未用的引物，在使用前應(yīng)進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，確保引物的完整性和有效性。

七、模板濃度過(guò)低

當(dāng)模板濃度過(guò)低時(shí)，可以減少模板稀釋倍數(shù)重復(fù)實(shí)驗(yàn)，在樣品濃度未知的情況下從最高濃度做起。此外，還可以嘗試其他方法，如提高引物濃度、優(yōu)化 PCR 反應(yīng)程序等，以提高實(shí)驗(yàn)的靈敏度。

八、Cq 值出現(xiàn)過(guò)早

擴(kuò)增效率低可能導(dǎo)致 Cq 值出現(xiàn)過(guò)早。解決方法包括提高引物濃度、嘗試三步法擴(kuò)增程序或者重新設(shè)計(jì)引物。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，要不斷優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，提高擴(kuò)增效率。

九、模板降解

如果模板降解，應(yīng)重新制備模板，重復(fù)實(shí)驗(yàn)。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，要注意保存模板，避免模板降解。

十、擴(kuò)增產(chǎn)物過(guò)長(zhǎng)

擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度應(yīng)控制在 80 - 200bp。過(guò)長(zhǎng)的擴(kuò)增產(chǎn)物可能會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。在設(shè)計(jì)引物時(shí)，要合理控制擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度。

十一、體系中存在 PCR 抑制劑

一般為模板帶入 PCR 抑制劑，可加大模板稀釋倍數(shù)或重新制備高濃度的模板重復(fù)實(shí)驗(yàn)。在實(shí)驗(yàn)前，應(yīng)對(duì)模板進(jìn)行處理，去除可能存在的 PCR 抑制劑。

十二、空白對(duì)照出現(xiàn)信號(hào)

空白對(duì)照出現(xiàn)信號(hào)可能是由于反應(yīng)體系污染。首先更換空白對(duì)照的水，如果還發(fā)生同樣情況，繼續(xù)更換引物、吸頭、PCR 管或啟用新的 Mix。反應(yīng)體系應(yīng)在超凈工作臺(tái)內(nèi)配制，減少氣溶膠污染。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，要嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作規(guī)范，避免反應(yīng)體系污染。

十三、出現(xiàn)引物二聚體等非特異性擴(kuò)增

一般在 35 循環(huán)以后空白對(duì)照出現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物屬正常情況，應(yīng)配合熔解曲線進(jìn)行分析。重新設(shè)計(jì)引物，調(diào)整引物濃度，優(yōu)化 PCR 反應(yīng)程序，可以減少非特異性擴(kuò)增。在設(shè)計(jì)引物時(shí)，要遵循引物設(shè)計(jì)原則，避免出現(xiàn)引物二聚體等非特異性擴(kuò)增。

十四、熔解曲線出現(xiàn)多峰

熔解曲線出現(xiàn)多峰可能是引物設(shè)計(jì)不佳。根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則重新設(shè)計(jì)新引物，可以改善熔解曲線的形狀。在設(shè)計(jì)引物時(shí)，要充分考慮引物的特異性和熔解曲線的形狀。

十五、引物濃度過(guò)高

適當(dāng)降低引物濃度可以解決引物濃度過(guò)高的問(wèn)題。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，要合理控制引物濃度，避免過(guò)高或過(guò)低的引物濃度對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生不良影響。

十六、cDNA 模板存在基因組污染

提取后的 RNA 溶液使用 DNA 酶進(jìn)行消化，例如：dsDNase，以去除基因組污染，或設(shè)計(jì)跨內(nèi)含子引物。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，要注意去除 cDNA 模板中的基因組污染，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

 十七、實(shí)驗(yàn)重復(fù)性差

加樣誤差大可能導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)重復(fù)性差。使用精準(zhǔn)的移液器、配合高品質(zhì)吸頭準(zhǔn)確移液；高倍稀釋模板，加入大體積模板減少加樣誤差；放大 qPCR 反應(yīng)體積等方法可以提高實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，要嚴(yán)格控制加樣誤差，提高實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性。

十八、qPCR 僅不同位置的溫度偏差

定期校準(zhǔn) qPCR 儀可以解決 qPCR 僅不同位置的溫度偏差問(wèn)題。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，要定期對(duì) qPCR 儀進(jìn)行校準(zhǔn)，確保儀器的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。

總之，在進(jìn)行 qPCR 實(shí)驗(yàn)時(shí)，實(shí)驗(yàn)人員應(yīng)熟悉常見(jiàn)問(wèn)題及解決方法，嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)操作規(guī)程，選擇質(zhì)量可靠的試劑和耗材，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。

 Longen Q2000B熒光定量QPCR 儀具有多類(lèi)型、多孔、多模塊等多重選擇，型號(hào)從普通的PCR儀到熒光定量PCR儀，從快速PCR儀到梯度PCR儀，種類(lèi)豐富，規(guī)格齊全，已滿(mǎn)足不同客戶(hù)群體的需求。PCR儀采用進(jìn)口半導(dǎo)體技術(shù)以及 MARLOW 半導(dǎo)體芯片制造商生產(chǎn)的半導(dǎo)體材料做為核心部件，確保產(chǎn)品的擴(kuò)增速度、分析結(jié)果及系統(tǒng)可靠性.

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蘇州阿爾法生物實(shí)驗(yàn)器材有限公司成立于2008年，位于蘇州園區(qū)生物納米園（Biobay）A5幢301室。公司管理團(tuán)隊(duì)專(zhuān)注于科學(xué)儀器行業(yè)十四年，擁有專(zhuān)業(yè)的技術(shù)團(tuán)隊(duì)與完善的售后服務(wù)體系，目前已為300余家實(shí)驗(yàn)室提供優(yōu)質(zhì)產(chǎn)品和服務(wù)，涵蓋各大高校、檢測(cè)中心、科研機(jī)構(gòu)、制藥企業(yè)等13個(gè)群體。提供的實(shí)驗(yàn)室儀器主要包括振蕩培養(yǎng)箱，恒溫恒濕培養(yǎng)箱、二氧化碳培養(yǎng)箱、生化培養(yǎng)箱、霉菌培養(yǎng)箱、PCR儀，瑞寧移液器，生物反應(yīng)器，發(fā)酵罐，超低溫冰箱，液氮罐，高壓滅菌器，超純水機(jī)，天平，離心機(jī)，離心濃縮儀、研磨機(jī)、葡萄糖乳酸分析儀等。廠商企業(yè)授權(quán)包括知楚儀器、朗基、中科美菱，梅特勒，樂(lè)楓，搏旅、NEST、天根、奧盛在內(nèi)的80個(gè)余廠家。