熒光定量 PCR 技術(shù)是一種高度靈敏且準(zhǔn)確的核酸定量檢測(cè)方法，而擴(kuò)增曲線的可靠性對(duì)于準(zhǔn)確判斷檢測(cè)結(jié)果比較重要。以下將詳細(xì)介紹在使用熒光定量 PCR 儀檢測(cè)時(shí)，判斷擴(kuò)增曲線可靠性的方法。

一、觀察擴(kuò)增曲線的形狀

正常的 S 型曲線：理想的擴(kuò)增曲線應(yīng)呈現(xiàn)典型的 S 型。在 PCR 反應(yīng)的起始階段，由于模板量較少，熒光信號(hào)增長(zhǎng)緩慢，此為基線期。隨著反應(yīng)的進(jìn)行，模板被指數(shù)級(jí)擴(kuò)增，熒光信號(hào)迅速上升，形成指數(shù)增長(zhǎng)期。當(dāng)反應(yīng)進(jìn)入平臺(tái)期，由于底物耗盡等原因，熒光信號(hào)不再明顯增加。若擴(kuò)增曲線呈現(xiàn)出清晰的 S 型，說明 PCR 反應(yīng)正常進(jìn)行，結(jié)果較為可靠。

例如，在一些研究中，如 Reference 1 中對(duì)發(fā)酵乳中雙歧桿菌的檢測(cè)，通過觀察擴(kuò)增曲線的形狀，可以初步判斷 DNA 提取方法和 PCR 擴(kuò)增效率。當(dāng)酶解法提取發(fā)酵乳中總 DNA 時(shí)，擴(kuò)增曲線呈現(xiàn)出較好的 S 型，說明該方法提取的 DNA 質(zhì)量較高，有利于后續(xù)的 PCR 反應(yīng)。

異常曲線的判斷：

非 S 型曲線：如果擴(kuò)增曲線不是 S 型，可能存在問題。例如，曲線呈現(xiàn)一直線，說明沒有發(fā)生 PCR 擴(kuò)增；曲線呈現(xiàn)不規(guī)則形狀，可能是由于反應(yīng)體系不穩(wěn)定、儀器故障或樣本污染等原因引起。

平臺(tái)期異常：如果平臺(tái)期過高或過低，可能意味著反應(yīng)體系存在問題。平臺(tái)期過高可能是由于模板量過多、引物二聚體形成或非特異性擴(kuò)增等原因；平臺(tái)期過低可能是由于模板量過少、反應(yīng)效率低下或熒光信號(hào)采集問題等原因。

二、分析擴(kuò)增曲線的參數(shù)

閾值循環(huán)（Ct 值）：Ct 值是指熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)所對(duì)應(yīng)的循環(huán)數(shù)。Ct 值的大小與模板起始量呈負(fù)相關(guān)，即模板起始量越多，Ct 值越小。在相同的實(shí)驗(yàn)條件下，Ct 值的重復(fù)性較好，可用于比較不同樣本中目標(biāo)基因的相對(duì)含量。一般來說，Ct 值在一定范圍內(nèi)波動(dòng)是正常的，但如果 Ct 值差異過大，可能說明實(shí)驗(yàn)存在問題。

例如，Reference 6 中通過對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)參數(shù)和待檢測(cè)樣品的檢測(cè)結(jié)果的分析，判斷實(shí)驗(yàn)室中兩臺(tái)不同型號(hào)的實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 儀檢測(cè)結(jié)果的一致性。其中，Ct 值的穩(wěn)定性是重要的判斷依據(jù)之一。如果兩臺(tái)儀器對(duì)相同樣本的 Ct 值差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），則說明檢測(cè)結(jié)果可靠。

擴(kuò)增效率：擴(kuò)增效率反映了 PCR 反應(yīng)的效率。理想情況下，擴(kuò)增效率應(yīng)在 90% - 110% 之間。擴(kuò)增效率可以通過標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率來計(jì)算。標(biāo)準(zhǔn)曲線是通過對(duì)一系列已知濃度的模板進(jìn)行 PCR 反應(yīng)，繪制熒光信號(hào)與模板濃度的對(duì)數(shù)之間的關(guān)系曲線。如果標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率在 -3.32 左右，說明擴(kuò)增效率接近 100%。

例如，Reference 4 中在建立肉制品中羊源性成分的實(shí)時(shí)熒光 PCR 鑒別方法時(shí)，通過構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算擴(kuò)增效率達(dá) 98.561%，符合《實(shí)時(shí)熒光定量國(guó)際化標(biāo)準(zhǔn) - MIQE 指南》要求，說明該方法的可靠性較高。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)參數(shù)：

線性關(guān)系：標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（R2）應(yīng)接近 1。如果 R2 值較低，說明熒光信號(hào)與模板濃度之間的線性關(guān)系不好，可能影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

靈敏度：標(biāo)準(zhǔn)曲線的靈敏度反映了檢測(cè)方法能夠檢測(cè)到的最低模板濃度。靈敏度越高，說明檢測(cè)方法能夠檢測(cè)到更低濃度的目標(biāo)基因，檢測(cè)結(jié)果越可靠。

例如，Reference 7 中建立的實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 檢測(cè)技術(shù)針對(duì) Metschnikowia bicuspidata 的線粒體細(xì)胞色素 c 氧化酶亞基 VIA（COX6A），標(biāo)準(zhǔn)曲線具有較高的相關(guān)系數(shù)（R2 = 0.996），檢測(cè)靈敏度低至 7.6×101 copies/μL，說明該方法具有較高的可靠性和靈敏度。

三、重復(fù)實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)重復(fù)性：為了判斷擴(kuò)增曲線的可靠性，應(yīng)進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)。重復(fù)實(shí)驗(yàn)可以在相同的實(shí)驗(yàn)條件下，對(duì)同一批樣本進(jìn)行多次檢測(cè)，觀察 Ct 值、擴(kuò)增曲線形狀等參數(shù)的重復(fù)性。如果重復(fù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果差異較小，說明實(shí)驗(yàn)的可靠性較高。

例如，Reference 8 中建立的五重?zé)晒舛?PCR 檢測(cè)四種瘧原蟲的方法，每個(gè)反應(yīng)做一式三份驗(yàn)證重復(fù)性，三個(gè)復(fù)孔的變異系數(shù)在 0.17 - 4.96 之間，說明該方法具有較好的重復(fù)性。

不同儀器和試劑的驗(yàn)證：可以使用不同的熒光定量 PCR 儀和試劑對(duì)同一批樣本進(jìn)行檢測(cè)，比較擴(kuò)增曲線和相關(guān)參數(shù)的一致性。如果不同儀器和試劑的檢測(cè)結(jié)果差異較小，說明檢測(cè)方法的可靠性較高。

四、結(jié)合其他方法進(jìn)行驗(yàn)證

熔解曲線分析：熔解曲線分析可以用于判斷 PCR 反應(yīng)的特異性。在 PCR 反應(yīng)結(jié)束后，通過逐漸升高溫度，使雙鏈 DNA 解鏈，熒光信號(hào)逐漸降低。如果 PCR 反應(yīng)產(chǎn)物特異性好，熔解曲線應(yīng)呈現(xiàn)單一的峰；如果存在非特異性擴(kuò)增或引物二聚體，熔解曲線可能會(huì)出現(xiàn)多個(gè)峰。

例如，Reference 0 中在開發(fā)新的低成本、多重實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)裝置 HDLRT-qPCR 時(shí)，通過進(jìn)行測(cè)試，顯示實(shí)現(xiàn)了與市售設(shè)備相當(dāng)?shù)奶荻葦U(kuò)增和熔解曲線，良好的一致性表征了測(cè)試結(jié)果，說明該裝置的可靠性較高。

與其他檢測(cè)方法對(duì)比：可以將熒光定量 PCR 檢測(cè)結(jié)果與其他檢測(cè)方法，如傳統(tǒng)的 PCR 方法、測(cè)序方法等進(jìn)行對(duì)比，驗(yàn)證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。如果兩種方法的檢測(cè)結(jié)果一致，說明熒光定量 PCR 檢測(cè)結(jié)果可靠。

在使用熒光定量 PCR 儀檢測(cè)時(shí)，可以通過觀察擴(kuò)增曲線的形狀、分析擴(kuò)增曲線的參數(shù)、進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)以及結(jié)合其他方法進(jìn)行驗(yàn)證等方式，判斷擴(kuò)增曲線的可靠性。這些方法可以相互補(bǔ)充，提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。

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