蛋白酶體是蛋白質(zhì)合成過程中錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)和其他蛋白質(zhì)被蛋白酶解的主要降解途徑。蛋白酶體抑制劑也被稱為蛋白酶抑制劑 是廣泛用于癌癥的輔助藥物。
蛋白酶體存在于所有真核細(xì)胞、古細(xì)菌和一些細(xì)菌中。它是一種多催化蛋白酶,由多種催化和調(diào)節(jié)蛋白組成。它具有三種或四種不同的肽酶活性,包括胰蛋白酶樣、糜蛋白酶樣和肽基谷氨酰肽水解活性。大多數(shù)蛋白質(zhì)在蛋白酶體降解之前被泛素化。據(jù)估計(jì),大約 20% 的 26S 蛋白酶體在沒有蛋白質(zhì)毒性應(yīng)激的情況下參與蛋白質(zhì)降解。
圖 1.泛素-蛋白酶體系統(tǒng)的示意圖。
蛋白酶抑制劑作為癌癥的輔助藥物,并在實(shí)驗(yàn)室研究中得到廣泛應(yīng)用。Bortezomib,也稱為 PS-341、Velcade 和 MG-341,是 經(jīng)FDA 批準(zhǔn)的用于骨髓瘤和套細(xì)胞淋巴瘤的藥物。還經(jīng)常用于實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)以抑制蛋白酶體活性。其他幾種蛋白酶體抑制劑也正在研究測(cè)試,包括雙硫侖、表沒食子兒茶素-3-沒食子酸酯、鹽孢菌胺 A、卡非佐米、ONX 0912、CEP-18770 和 MLN9708等。
常用的蛋白酶體抑制劑的主要特征
抑制劑 |
機(jī)制 |
應(yīng)用 |
貯存 |
備注 |
MG132 |
可逆的 |
~10uM,1 小時(shí) |
-20°C |
較便宜,還抑制 NF-kB 激活 (IC50 = 3 uM) 和鈣蛋白酶 |
乳胞素 |
不可逆轉(zhuǎn) |
~10 微米,2 小時(shí) |
-20°C |
稍貴,還抑制 NF-kB 活化,比 MG132 更具蛋白酶體活性特異性 |
蛋白酶體抑制劑 I |
可逆的 |
|
-20°C |
|
表 2。蛋白酶體抑制劑的主要特征、處理濃度、儲(chǔ)存、實(shí)驗(yàn)室研究
MG132
MG132,也稱為carbobenzoxy-L-leucyl-L-leucyl-L-leucinal,Z-LLL-CHO,是一種肽醛,是一組能夠抑制不同類型蛋白酶的化學(xué)物質(zhì)之一,包括絲氨酸蛋白酶、鈣蛋白酶等. MG132 和其他肽醛已被證明能強(qiáng)烈抑制蛋白酶體的多種肽酶活性和鈣蛋白酶活性 。
MG132蛋白酶抑制劑的應(yīng)用
細(xì)胞類型 |
備注(處理時(shí)間/濃度) |
A. polyphaga細(xì)胞, HEK293 細(xì)胞 |
0.1 uM,感染前 1 小時(shí)并始終保持 |
A431 細(xì)胞 |
10 微米 |
擬南芥原生質(zhì)體 |
1-10 微米,2 小時(shí) |
COS-7 細(xì)胞 |
25 微米,5 小時(shí) |
COS-7,海拉細(xì)胞 |
20 微米,24 小時(shí) |
H1299、HeLa、U2OS 細(xì)胞 |
10 微米,12 小時(shí) |
海拉細(xì)胞 |
20 毫米,24 小時(shí) |
HEK293 細(xì)胞 |
20 微米,3-6 小時(shí) |
HEK293 細(xì)胞 |
1 微米,16 小時(shí) |
HEK293T細(xì)胞 |
50 uM,4 到 7 小時(shí) |
乳腺上皮細(xì)胞 |
10 微米,4 小時(shí) |
RAW 264.7 單元格 |
50 uM,3 到 6 小時(shí) |
酵母 |
60 uM ,至少四個(gè)小時(shí) |
表 1。上表中表示 MG132 應(yīng)用(處理時(shí)間和濃度)。
蛋白酶體是細(xì)胞功能的組成部分。MG132 和其他蛋白質(zhì)體抑制劑對(duì)細(xì)胞和組織有毒性,在高濃度或長時(shí)間感染后會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。建議在一定范圍內(nèi)滴定適宜濃度(例如,1000x)。適宜濃度不僅取決于特定的細(xì)胞類型,還取決于細(xì)胞培養(yǎng)參數(shù),例如細(xì)胞匯合度、血清濃度和培養(yǎng)基成分。
MG132 應(yīng)儲(chǔ)存在 -20°C,可溶解在 DMSO (10 mg/ml) 或甲醇 (1 mg/ml) 中,分裝并儲(chǔ)存在 -20 或 -80°C。如果 MG132 DMSO 溶液在添加到培養(yǎng)基中時(shí)產(chǎn)生沉淀,可以將 DMSO 原液加熱至 40°C。
圖 2. MG132 的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
乳胞素
Lactacystin 是一種抗生素,從鏈霉菌中分離出來,現(xiàn)在可以化學(xué)合成。它在細(xì)胞和體內(nèi)水解成 clasto-lactacystin beta-lactone,這可能是共價(jià)修飾哺乳動(dòng)物 20S 蛋白酶體中 X 亞基的 N 末端蘇氨酸的活性抑制劑。共價(jià)結(jié)合是特異性的,因此它不會(huì)影響半胱氨酸或絲氨酸蛋白酶,其表現(xiàn)比肽醛(如 MG132)好。
圖 3. lactacystin 的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
Lactacystin 可以在細(xì)胞培養(yǎng)中以 10 uM、25 uM 使用數(shù)小時(shí)。
細(xì)胞類型 |
感染時(shí)長及濃度 |
BxPC-3 |
10 uM, 12, 24, 48 小時(shí) |
HEK-293T 細(xì)胞 |
25 uM,4 到 7 小時(shí);10 微米,10 小時(shí) |
RAW 264.7 單元格 |
10 微米,2 小時(shí) |
表 2。表格中為 lactacystin 應(yīng)用示例(處理時(shí)間和 lactacystin 濃度)。
lactacystin常用于研究桿菌水腫毒素對(duì)核糖原合酶激酶 3beta 的影響,以及研究 LRRK2 泛素化和降解的調(diào)節(jié)。
蛋白酶體抑制劑 I
蛋白酶體抑制劑 I (PSI)用于孵育轉(zhuǎn)染細(xì)胞和 Peptide Institute 蛋白酶體抑制劑 PSI (N-carbobenzoxy-L-isoleucyl-L-gamma-t-butyl-L-glutamyl-L-alanyl-L- leucinal) 用于處理細(xì)胞。
Velcade(PS-341、MG-341、硼替佐米)在實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)中用于抑制蛋白酶體活性。Velcade 細(xì)胞毒性已檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)中用 50 uM/L Velcade 處理 8 小時(shí)的 HEK-293 細(xì)胞沒有明顯的細(xì)胞損失。而使用濃度在 0.5 至 50 μmol/L 的Velcade 長時(shí)間孵育(24 小時(shí))導(dǎo)致約 40% 的細(xì)胞死亡 。
XAV 939
ADP-核糖基 轉(zhuǎn)移酶tankyrase (TNKS) 對(duì)PI31 的ADP-核糖基化抑制PI31 的20S 抑制,從而促進(jìn)26S 蛋白酶體活性。 XAV939是一種 TNKS 的小分子抑制劑,可阻斷 PI31 ADP-核糖基化。
蛋白酶體抑制的驗(yàn)證
使用蛋白酶體抑制的主要目的就是降低蛋白酶體活性的減弱。一般通過以下兩種方法進(jìn)行驗(yàn)證:一是通過Suc-LLVY-AMC(N-succinyl-L-leucyl-L-leucyl-L-leucyl-7-amido-4-methylcoumarin)作為熒光蛋白酶體活性指示劑。泛素融合降解底物 Ub-G76V-GFP 在蛋白酶體抑制時(shí)發(fā)出熒光。另一種方法是通過蛋白質(zhì)印跡檢查單泛素和多泛素部分水平之間的比率。如果蛋白酶體活性受到抑制,則應(yīng)該有較低水平的單泛素。
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